2024年10月9日，太行本草研究院师生在科研楼202会议室开展组会学习，本次由胡英还老师进行“敲低/过表达细胞系构建”专题分享。
敲低（Knockdown）和过表达（Overexpression）细胞系的构建是现代分子生物学研究中的重要技术手段，它们对于理解基因功能、疾病机理以及药物开发等方面具有重要的研究意义。
一、敲低（Knockdown）细胞系构建
敲低是指通过RNA干扰（RNAi）、CRISPR/Cas9等技术降低特定基因的表达水平，从而研究该基因的功能。
本专题主要介绍RNA干扰技术，RNAi是指一些小的与靶基因序列同源的双链RNA(dsRNA)可以高效、特异性地阻断体内特定基因表达，促使mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，它也是体内抵御外在感染的一种重要保护机制。
图1 miRNA (A)和siRNA(B)工作机制原理图
siRNA是RNAi技术中的关键分子，它是由双链RNA分子组成的，可以与目标基因的mRNA特异性结合并介导其降解。siRNA的合成通常通过化学合成或体外转录的方式进行，确保siRNA的纯度和稳定性。RNAi抑制基因表达的机理如下图所示。
图2 RNAi抑制基因表达的机理
具体构建步骤：
目标基因选择：确定要敲低的基因。
设计靶向序列：设计特异性的siRNA、shRNA序列，靶向该基因的mRNA。
载体构建：将设计的序列克隆到表达载体中，如shRNA表达载体中。
细胞转染：将构建好的载体转染到目标细胞中。
筛选稳定细胞系：使用抗生素筛选或其他方法筛选出稳定整合载体的细胞。
验证敲低效率：通过RT-qPCR、Western blot等方法验证目标基因的表达水平是否下降。
二、过表达（Overexpression）细胞系构建
过表达是指通过转染或转导含有目标基因的表达载体，使得特定基因在细胞中的表达水平高于正常水平。其构建过程与敲低细胞系构建类似，具体如图3所示。
图3 过表达细胞体系构建的过程
具体构建步骤：
目标基因克隆：将目标基因克隆到表达载体中，通常在载体中包含强启动子以驱动基因的高表达。
载体构建：构建过表达载体，可以选择带有抗性基因的载体以便筛选。
细胞转染：将构建好的载体转染到目标细胞中。
筛选稳定细胞系：使用抗生素筛选或其他方法筛选出稳定表达目标基因的细胞。
验证过表达水平：通过RT-qPCR、Western blot等方法验证目标基因的表达水平是否提高。
三、细胞转染
细胞转染是一种将外源核酸（如DNA或RNA）导入细胞的技术，可分为瞬时转染和稳定转染两大类。二者区分关键在于是否整合到细胞的染色体中。主要用于研究基因功能、基因表达调控、信号传导途径以及药物作用机制等。在构建敲低/过表达细胞系的过程中，均会涉及到细胞转染。
瞬时转染：mRNA或蛋白质产物必须在短时间内(1～3天)进行测定，否则随着细胞的生长和分裂，质粒会被降解或稀释。瞬时转染分析法快捷、简单，易于对结果定量，因此成为启动子功能分析的首选方法。
稳定转染：操作难度较大，需要的时间较长。但是能使调控区能更精确地模拟正常功能。对随后的转录分析没有时间限制。转染的方法主要有：
（1）物理介导
电穿孔法（瞬时转染、稳定转染、所有细胞）
显微注射（瞬时转染、稳定转染）
基因枪（瞬时转染）
（2）化学介导
DEAE-葡聚糖法（瞬时转染）
磷酸钙法(瞬时转染、稳定转染)
脂质体转染法（瞬时转染、稳定转染、所有细胞）
（3）生物介导-病毒介导法
逆转入病毒介导的转染（稳定转染特定宿主细胞）
腺病毒介导的转染（瞬时转染特定宿主细胞）
细胞转染的一般步骤包括：
（1）选择转染方法：根据实验目的和细胞类型选择合适的转染方法，如脂质体介导的转染、电穿孔、病毒介导的转染等。
（2）准备细胞：将细胞培养至适当的密度和状态，以确保最佳的转染效率。
（3）配制转染复合物：将外源核酸与转染试剂混合，形成能够与细胞膜相互作用的复合物。
（4）添加复合物至细胞：将核酸-转染试剂复合物添加到细胞培养基中，使复合物与细胞接触。
（5）孵育：将细胞在适宜条件下孵育，使外源核酸进入细胞并表达。
（6）筛选和选择：对于稳定转染，需要使用抗生素或其他选择性标记物筛选出成功转染的细胞克隆。
（7）表达分析：通过各种分子生物学技术（如RT-qPCR、Western blot）分析外源基因的表达情况。
注意事项：
（1）细胞健康：确保转染前细胞健康、活力好，避免使用老化或污染的细胞。
（2）转染效率：不同的转染方法和试剂对不同的细胞系效率可能不同，需要预先优化转染条件。
（3）毒性问题：某些转染试剂可能对细胞有毒性，需要选择合适的试剂和优化转染条件以减少细胞毒性。
（4）无菌操作：整个转染过程中需要保持无菌操作，避免细胞污染。
选择标记物的使用：对于稳定转染，需要使用选择标记物来筛选稳定表达的细胞系，如抗生素抗性基因。
（5）实验重复：为了确保结果的可靠性，每个实验条件应至少重复三次。
（6）转染技术的选择和优化是成功转染的关键，需要根据实验的具体需求和细胞的特性来确定最佳方案。
四、应用
敲低/过表达细胞系的应用范围很广，主要有以下几个方面：
（1）基因功能研究：通过观察基因表达改变后的细胞表型变化，推断基因的功能。
（2）疾病机理研究：模拟疾病状态下的基因表达变化，研究疾病的发生和发展。
（3）药物筛选：用于高通量筛选，测试化合物对特定基因表达的影响。
（4）信号通路分析：研究基因在细胞信号传导中的作用。
