2024年9月11日，太行本草研究院师生在科研楼202会议室开展组会学习，本次由2022级硕士研究生叶桂芳进行“微生物群驱动应激肠道中色氨酸代谢的昼夜节律”文献精读。

背景介绍

慢性压力会损害精神和身体健康，从而促进或加剧疾病的发展和进展。应激的生理效应通常表现在肠道中，改变了微生物-肠道-大脑的交流，大量研究表明，慢性应激暴露会改变肠道屏障功能，色氨酸代谢和微生物群组成。然而，关于急性应激，即慢性应激的“组成部分”，对肠道内稳态和色氨酸代谢之间的界面的影响，知之甚少。在许多与压力相关的疾病中，表现出昼夜节律破坏，因此，这是急性应激研究中的一个关键考虑因素。本文作者通过无菌和抗生素消耗微生物的小鼠来了解色氨酸代谢中的微生物依赖性振荡如何改变基线时的肠道屏障功能和对急性应激源的反应，盲肠代谢组学发现色氨酸代谢对15分钟急性应激源反应最敏感，而散弹枪宏基因组学显示，大多数表现出节律性的细菌物种代谢色氨酸。以上结果证明微生物群驱动应激肠道中色氨酸代谢的昼夜节律。

结果与讨论

作者首先给小鼠灌胃荧光素-5-异硫氰酸酯（FITC）-右旋聚糖，然后评估应激反应前后的循环FITC浓度，研究15 min急性抑制应激是否足以影响常规或抗生素治疗小鼠的肠道通透性。结果发现在常规和抗生素处理的小鼠中，约束应激后立即短暂地增加了体内细胞旁通透性，45min后回到正常水平。表明了抗生素消耗微生物并不会改变应激对胃肠道细胞旁通透性的影响。为了进一步了解这种动态应激反应中涉及的微生物-宿主相互作用，对常规、无菌和定植无菌小鼠应激时和应激后45min的盲肠内容物进行代谢组学分析，主成分分析结果显示应激和微生物状态改变了代谢组组成，代谢富集通路结果显示色氨酸代谢是影响常规小鼠急性应激暴露影响最大的途径，而对个体代谢物水平的结果表明常规小鼠应激后色胺水平发生改变，定植小鼠应激后醋酸酯水平发生变化改变，而在定植小鼠应激后，3-甲酰肌酸和N-乙酰色氨酸等代谢物水平发生变化，结果表明盲肠内容物中与应激相关的色氨酸代谢物的变化既依赖于成年期的微生物群，也在较小程度上依赖于其在发育过程中对肠道稳态的影响。

然后对常规小鼠的盲肠内容物进行微生物群测序，研究在菌株水平上微生物的昼夜节律振荡。Chao1指数结果显示微生物物种丰富度表现出昼夜节律性，主成分分析结果显示微生物物种组成随一天时间的变化而变化，热图聚类了6中含代谢色氨酸的基因且表现出相对丰度的节律性的菌株。此外，使用肠道代谢模块（GMMs）和肠道大脑模块（GBM）检测微生物组在一天中功能能力，将微生物KEGG同源物分别分组为对宿主代谢和中枢神经系统功能有潜在意义的功能行业。结果显示GMMs中有26个，GBMs中有13个功能表现出昼夜节律性，这些功能包括短链脂肪酸合成、组胺合成和降解以及一 氧化氮的合成和降解，虽然微生物色氨酸的降解没有明显的节律性，但它在ZT11时相对于ZT17有所升高，此外，微生物的犬尿胺降解具有明显的节律性。上述结果表明几种色氨酸代谢细菌的相对丰度、微生物色氨酸代谢能力和预测的色氨酸代谢物均表现出日变化的差异。

接下来，进一步确定一个完整的微生物群对宿主胃肠道功能的昼夜节律性是否是必要的，特别是在屏障功能和色氨酸代谢方面。首先是通过RT-PCR对常规、无菌和抗生素处理小鼠的回肠和结肠组织中检测色氨酸代谢相关酶Tph1、Ido1、Ahr和Pxr基因。结果显示在常规小鼠的回肠中，Tph1显示了昼夜节律性，Ido1 没有显示昼夜节律，表明当色氨酸在回肠中转化为血清素时，存在时间依赖性效应，但在无菌状态下，Tph1失去节律性。而抗生素处理降低了Ido1的表达，无菌状态降低程度较小。此外，所有实验组的AhR和Pxr表现出昼夜节律性，其中Pxr基因在无菌状态的表达峰值向非活性期中期的转移相关，而抗生素处理降低了节律的幅度，表明色氨酸信号通路中的回肠日节律性仅被无菌状态所破坏。在结肠中，常规小鼠结肠中Tph1和Ido1基因表达表现出相互的昼夜节律，抗生素处理和无菌状态破坏了两者的昼夜节律，并降低整体基因的表达，抗生素处理和无菌状态使Ahr的表达升高，其中，无菌状态诱导了昼夜节律。正常小鼠Pxr基因表达表现出昼夜节律，抗生素处理部分减弱，无菌状态完全渐弱，表明微生物的破坏导致了结肠中色氨酸代谢和信号传导的改变。综上结果表明无菌状态和微生物消耗与分子时钟中的昼夜基因表达中断以及胃肠道中的色氨酸代谢和信号转导有关，无菌状态在回肠和结肠中都会破坏途径，而微生物消耗破坏结肠中途径。

其次，由于色氨酸代谢物可以调节屏障功能，因此检测上皮细胞和黏液屏障完整性的标记物基因表达，观察是否也会发生类似的日变化。结果显示常规小鼠回肠中测量到的基因中没有一个表现出昼夜节律性，而无菌状态诱导了闭塞蛋白（Ocln）、claudin-1和Muc2昼夜节律性变化，抗生素处理诱导了Ocln、Cldn5、Muc2和Muc3的昼夜节律性变化。在结肠中，常规小鼠中肠道上皮屏障和黏液屏障相关基因均表现出昼夜节律，抗生素处理增加了Tjp1和Ocln整体表达，无菌状态消除了昼夜节律性。此外，无菌状态和抗生素处理增加Claudin-1和Cldn5整体表达，表明抗生素消耗的微生物和无菌状态都会影响肠道屏障完整性相关基因的昼夜节律性其中无菌状态会诱导结肠发生更多的变化。以上结果表明抗生素消耗的微生物和无菌状态都会影响肠道屏障完整性相关基因的昼夜节律性其中无菌状态会诱导结肠发生更多的变化，微生物群在肠道屏障相关基因表达的适当昼夜节律的发展中以及在维持这些节律中发挥了作用。

此外，色氨酸酶是色氨酸转化为铟的关键酶，在革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中均有表达，可能不同抗生素暴露的会产生不同影响。因此，通过使用万古霉素（革兰氏阳性消耗）、庆大霉素（革兰氏阴性消耗）及之前实验中使用的广谱抗生素鸡尾酒治疗小鼠，Ussing室仪器测量电生理特性和细胞旁通透性评估体外肠道功能。结果显示回肠中，常规小鼠离子转运表现出昼夜节律，抗生素处理后，离子转运保持了节律性，但峰值转移到光-暗间期，庆大霉素和万古霉素处理后消除了离子转运的节律性，同时万古霉素还诱导了上皮电阻（TEER）的节律性，与常规小鼠比较，抗生素处理组没有改变回肠细胞通透性。在结肠中，只有离子转运表现昼夜节律，与常规小鼠比较，所有抗生素处理组的峰值出现在明暗间期；万古霉素处理后，结肠TEER整体升高，抗生素处理后，降低了细胞旁通透性。这些结果显示万古霉素治疗改变了回肠功能和结肠基因表达（补充），而抗生素鸡尾酒改变了这两个区域的离子转运，表明万古霉素和全抗生素鸡尾酒对肠道屏障功能和相关基因表达的昼夜节律的影响最为广泛，，革兰氏阳性细菌的消耗可能是观察到的影响的基础。

由于研究结果已经表明色氨酸代谢和肠道屏障功能之间存在相互作用，因此评估了色氨酸相关的基因表达。结果显示常规小鼠在回肠中检测的基因只有Ido1表现出昼夜节律，而各抗生素处理后Tph1整体表达升高，鸡尾酒抗生素和庆大霉素处理均降低Ido1基因表达，鸡尾酒抗生素处理后Ido1节律性被保留。此外，万古霉素诱导Ahr和Trpa1的节律性，庆大霉素诱导Ahr节律性，抗生素鸡尾酒处理后诱导Pxr和Trpa1的节律性。常规小鼠结肠中检测的基因Ido1，Pxr和Trpa1表现出昼夜节律，各抗生素处理后Tph1整体表达降低，鸡尾酒抗生素和万古霉素处理均降低Ido1和Ahr基因表达，但鸡尾酒抗生素处理后Ido1节律性被保留。此外万古霉素和庆大霉素消除诱导Pxr的节律性，抗生素处理不受影响，而Trpa1在所有实验组中都表现出节律性，但所有抗生素处理组都降低了整体基因的表达。这些结果表明各抗生素处理都改变了回肠色氨酸相关受体的昼夜节律，万古霉素和鸡尾酒抗生素改变了结肠中Ido1表达的昼夜节律性，而庆大霉素改变了Ahrr的节律性。

随后通过吲哚（Indole）检测试剂盒和吲哚乙酸（IAA）检测试剂盒检测盲肠内容物Indole和IAA浓度，研究对革兰氏阳性或革兰氏阴性微生物的不同抗生素暴露对微生物衍生色氨酸代谢物水平的影响（这些代谢物水平已证明了被急性应激改变）。结果显示常规小鼠盲肠中吲哚浓度表现出昼夜节律，各抗生素处理后均消除吲哚节律性吲哚乙酸在任何实验组都没有表现出昼夜节律，同时各抗生素处理后激活AhR能力均降低，其中以鸡尾酒抗生素处理后最显著，但这些变化没有变现出节律性。这些结果表明微生物消耗影响肠道色氨酸水平与抗生素无关。

最后，进一步研究微生物消耗对肠道屏障功能和宿主色氨酸代谢的昼夜节律性的影响是否是肠道对急性约束应激反应的重要因素。在回肠中，离子转运不受抗生素处理和急性应激的影响，但TEER受到应激而降低，细胞旁通透性受到应激而增加，抗生素处理仅在ZT23增加Occludin表达，而Claudin-5不受任何干预的影响。在结肠中，离子转运表现出昼夜节律效应，抗生素处理后TEER增加，细胞旁通透性受时间影响，急性应激后降低了Occludin表达，并在ZT23时整体升高；抗生素应激降低了Claudin-5表达。

在回肠中，抗生素处理后Tph1和Ido1在ZT11时的表达比在ZT11时表达降低，急性应激后，CYPla1增加表达增加，表明应激小鼠回肠中Ahr的活性增加。在结肠中，正常应激小鼠Tph1的表达降低，而抗生素应激表达增加。抗生素处理后，Ido1表达水平降低，并在ZT23时整体降低，正常应激增加了CYPla1表达，抗生素应激处理后在ZT23时CYPla1表达增加。这些结果表明微生物群驱动急性约束应激肠道中色氨酸代谢的昼夜节律。

总结

综上，本研究表明，慢性应激会破坏微生物-肠-脑轴功能，并与色氨酸代谢改变、肠道屏障功能受损和昼夜节律紊乱有关；胃肠道对急性应激的反应依赖于一天中的时间和微生物群，具有应激诱导的回肠功能改变和结肠中色氨酸代谢改变的特征。